《中国肿瘤生物治疗杂志》
恶性肿瘤已经成为危害人类健康的主要疾病，传统的治疗方法主要是手术、放疗、化疗等，但这些方法存在副作用大、易耐药、易复发等缺点。随着科学技术发展，生物治疗逐渐走进人们的视野。树突状细胞(dendritic cells，DC)是人体内目前已知功能最强大的抗原提呈细胞，能够刺激机体生成具有肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞，以抗原特异性的方式识别并清除肿瘤细胞，以DC为基础制备的肿瘤疫苗，在多种肿瘤模型动物实验及临床试验中显示出一定的治疗效果[1-3]。
PD-L1(又称CD279)是人体内的负性调节蛋白，作为PD-1的配体，在肿瘤上表达，与肿瘤的侵袭性、预后、死亡风险性等密切相关[4]。有研究[5-7]报道，PD-L1在多种肿瘤中高表达，包括肝癌、肾癌、肺癌等。PD-L1与其受体PD-1结合后，对淋巴细胞产生抑制作用，促进肿瘤细胞发生免疫逃逸。因此，我们在研究中联合树突状细胞疫苗和抗PD-L1抗体，探究对小鼠肝癌的治疗效果。
1材料与方法
1.1实验动物、细胞和主要试剂
SPF级C57BL/6J雌性小鼠，6～8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司；小鼠肝癌细胞系H22细胞由本实验室保存；抗PD-L1抗体购自bioxcell公司；重组小鼠GM-CSF和重组小鼠IL-4购自Peprotech公司；Anti-mouse CD11c-PE流式抗体购自eBioscience公司；检测干扰素γ(IFN-γ)的ELISA试剂盒购自Sigma Aldrich公司；RPMI-1640培养基，胎牛血清购自四季青Hyclone公司；红细胞裂解液购自碧云天公司。
1.2小鼠髓源树突状细胞的提取、培养及鉴定
将健康的6～8周龄雌性C57BL/6J小鼠颈椎脱臼处死后立即浸泡在体积分数为75%的酒精中，5 min后，在无菌环境下取出小鼠股骨和胫骨，暴露髓腔，用1640冲洗至骨髓腔成白色，细胞悬液通过200目筛网，离心，沉淀用红细胞裂解液裂解红细胞，离心后沉淀用含有20 ng/mL GM-CSF，20 ng/mL IL-4，10% FBS和1%的青链霉素的RPMI-1640培养基调整细胞数至1×106/mL，加入6孔板中培养，提取当天为第1天，第3天，第6天半量换液，第7天加入10ng/mL TNF-a诱导DC成熟。取加入TNF-a 24 h后的细胞，用抗小鼠CD11c-PE抗体染色，流式细胞仪分析细胞表面CD11c的表达。
1.3小鼠髓源树突状细胞疫苗的制备
将H22小鼠肝癌细胞收集到离心管中，在水浴锅和液氮中反复冻融5个循环，获得H22细胞全抗原。按照上述方法，取第7天获得的未成熟DC，与反复冻融获得的肿瘤全抗原以1∶3比例混合，并加入含10 ng/mL TNF-a，20 ng/mL GM-CSF，20 ng/mL IL-4，10% FBS的1640完全培养基，继续培养24 h，获得成熟的树突状细胞疫苗。
1.4小鼠肝癌模型建立及肿瘤治疗试验
取C57BL/6J小鼠40只，将5×105的H22肝癌细胞接种于每只小鼠左侧腋下。3 d后，小鼠随机分成4组，每组10只。分组如下：DC疫苗治疗组，在肿瘤接种后第3天与第10天，将1×106经过肿瘤全抗原刺激后的成熟DC注射进小鼠右侧腹皮下；抗PD-1抗体治疗组，在肿瘤接种后第3天与第10天，将100 μg抗PD-1抗体注入小鼠腹腔内。肿瘤接种后28 d，处死小鼠，用游标卡尺测量肿瘤长、短径，按照公式计算肿瘤大小。
1.5小鼠淋巴细胞肿瘤杀伤实验
肿瘤接种后28 d，处死小鼠后，在无菌环境下，取对照组和不同治疗组小鼠的脾脏。在无菌200目筛网上研磨，获得单细胞悬液，裂解红细胞后，加入到淋巴细胞分离液，离心后按照说明书取淋巴细胞层，获得小鼠脾淋巴细胞，一部分作为效应细胞，另一部分用来检测干扰素γ的分泌。H22肝癌细胞作为靶细胞，根据LDH说明书确定最佳靶细胞数量，按效靶比5∶1，10∶1和40∶1接种到U型底96孔板中，严格按照说明书操作。
1.6干扰素γ水平的检测
将上述得到的小鼠脾淋巴细胞的一部分作为效应细胞，H22肝癌细胞作为靶细胞，按照效靶比20∶1混合于U型底96孔板中培养72 h后，使用小鼠干扰素γ酶联免疫试剂盒，按照说明书流程检测培养上清中IFN-γ的含量。
1.7统计学分析
采用GraphPad Prism软件处理数据。实验数据以“均数±标准差”表示，组间比较采用t检验，P<0.05，具有统计学意义。
2结果
2.1小鼠髓源树突状细胞的培养及鉴定
光学显微镜下观察，第1天，细胞圆且清亮，均匀悬浮于培养基中。细胞培养过程中，逐渐出现增殖性集落，并且细胞出现不规则形状，部分细胞出现“毛刺状”突起；细胞培养第7天，集落呈半悬浮状态，且大部分细胞表面有突起结构。