中国肿瘤生物治疗杂志

靶向性氧化石墨烯白术内酯对卵巢癌细胞凋亡及 

来源:中国肿瘤生物治疗杂志 【在线投稿】 栏目:期刊导读 时间:2021-05-08

0 引言 Introduction

卵巢癌是生殖性癌症中最常见的类型,也是导致妇女癌症死亡的第五大原因,2018 年卵巢癌成为全球女性发病率第七高的癌症,新增约24 万人[1-2]。顺铂和紫杉醇是治疗卵巢癌的一线药物,然而顺铂会造成严重的肝肾损害及外周神经性病变;同时由于缺乏对肿瘤组织的选择性,紫杉醇也存在着较为严重的毒副作用,因此有必要为癌症确诊患者制定新的治疗策略。

天然化合物以其高抗肿瘤活性和低毒性引起了研究人员的广泛关注。白术内酯Ⅰ(atractylenolide-I,AT-Ⅰ)是从白术中分离得到的一种天然倍半萜内酯,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理和生物学活性[4-7]。先前的研究表明,AT-Ⅰ可激活膀胱癌细胞线粒体凋亡途径,诱导细胞周期阻滞在G2/M 期并触发细胞凋亡[6]。AT-Ⅰ还通过调控ERK/GSK3β 信号通路来诱导黑色素瘤细胞的凋亡和细胞周期阻滞效应[7]。此外一项临床研究表明,AT-Ⅰ改善了胃癌恶病质患者的食欲和Karnofsky 表现状态,且观察到的不良反应较少[8]。以上这些研究表明AT-Ⅰ是一种很有前途的抗肿瘤药物,但AT-Ⅰ水溶性差、光照不稳定、渗透性低,生物利用度低,限制了其临床应用[9]。因此,为提高AT-Ⅰ的溶解度、降低口服给药的首过效应、提高生物利用率,有必要选择合适的纳米给药系统[10]。

氧化石墨烯(graphene oxide,GO)以其良好的水溶性、大的比表面积、良好的生物相容性而备受关注,其可通过π-π*堆积、静电吸引和其他分子相互作用来装载治疗药物。实验通过活化GO 表面的羧基,以聚乙二醇为中介实现精氨酸甘氨酸天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid,RGD)和GO 的共价枝接,随后通过溶剂共混完成对AT-Ⅰ的负载,成功制备负载AT-Ⅰ的RGD@GO 纳米粒子(RGD@GO-AT-Ⅰ),并对其粒径、包封率、载药量及体外口抗肿瘤作用进行评价。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 体外观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2018 年10 月至2019 年12 月在青海大学附属医院实验室完成。

1.3 材料 AT-Ⅰ(索宝来生物科技公司);人卵巢癌细胞A2780(美国ATCC,Manassas,VA);N-(3-二甲氨基丙基-N’-乙基碳化二亚胺盐酸盐)(EDC)、二吡咯烷(NSUC)、六氟磷酸碳(HSPyU)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、聚乙二醇(Sigma Aldrich);RGD 多肽序列(北京中科亚光生物科技有限公司);GO(南京吉仓纳米科技有限公司);Dulbecco 改良的Eagle’s 培养基(Gibco,Inc,纽约大岛);胎牛血清(Hyclone,Co);碘化丙啶染色液(Sigma-Aldrich Co,美国);原子力显微镜(VEECO Dimension icon,美国);高效液相色谱检测仪(Ultimate 3000,Dionex,Inc.US);FAC Scaliber 流式细胞仪(Becton-Dickinson 公司,美国);Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒(Sigma-Aldrich)。

1.4 实验方法

1.4.1 RGD@GO 的合成 将10 mL GO 溶液(约4 g/L)水浴1 h。此后,将1.2 g NaOH 和1.0 g 氯乙酸加入到GO 溶液中继续水浴3 h。加入盐酸中和,最终产物为羧酸改性GO(GO-COOH)。将改性GO 用水稀释至约1 g/L,然后用10 g/L 聚乙二醇对其进行超声水浴5 min。然后添加浓度为5 mmol/L 的EDC 超声处理30 min,然后添加过量的EDC 搅拌12 h,添加巯基乙醇终止反应。1 h 后,在PBS 中离心得到聚乙二醇化的GO 溶液,保存上清液。随后将质量浓度为 1 g/L 的 RGD 多肽水溶液100 μL 滴加到聚乙二醇化的GO 表面,室温孵育4 h,使RGD多肽以共价方式枝接在聚乙二醇化的GO 表面,得到RGD@GO。

1.4.2 载药纳米材料的制备 将5 mL 的RGD@GO(0.05 g/L)或GO(0.05 g/L)与0.5 mL 的AT-Ⅰ DMSO 溶液(2.5 mmol/L)混合,在室温下搅拌过夜。离心,将上清液通过0.45 μm 过滤器过滤,去除固体,将保留在过滤器中的GO-AT-Ⅰ或RGD@GOAT-Ⅰ清洗4-6 次,重新悬浮在去离子水中形成的GO-AT Ⅰ或RGD@GO-AT-Ⅰ,4 ℃下贮存。

1.4.3 载药纳米材料的粒径和厚度 使用原子力显微镜对GO 和RGD@GO-AT-Ⅰ的粒径和厚度进行表征。通过将5 μL质量浓度为6 mg/L 的液体悬浮液滴在云母上,置于直径为12 mm 的金属盘上;将样品密封在经Drierite?颗粒除湿的仪器室中,并通过标准优化和一系列成像设置进行成像;样品表面用30-50 μL 去离子水冲洗2 次,去除沉积盐,温和气流干燥,检测样品,使用Nanoscope 软件(7.3 版,Bruker,CA)进行评估。

1.4.4 载药纳米材料的载药量及体外释药 AT-Ⅰ的浓度通过配备C18、4.6×250 mm 色谱柱的高效液相色谱在323 nm 处测定其含量。采用高效液相色谱法测定RGD@GO-AT-Ⅰ溶液体外释放AT-Ⅰ的浓度和载药量。将5 mL 的RGD@GO(0.05 g/L)与0.5 mL 的 AT-Ⅰ DMSO 溶液(2.5 mmol/L)混合,搅拌过夜,离心,检测上清液中AT-Ⅰ的含量,根据以下公式计算载药量:载药量(%)=(总药量-上清液药物含量)/纳米载体质量×100%。

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