0 引言 Introduction

卵巢癌是生殖性癌症中最常见的类型，也是导致妇女癌症死亡的第五大原因，2018 年卵巢癌成为全球女性发病率第七高的癌症，新增约24 万人[1-2]。顺铂和紫杉醇是治疗卵巢癌的一线药物，然而顺铂会造成严重的肝肾损害及外周神经性病变；同时由于缺乏对肿瘤组织的选择性，紫杉醇也存在着较为严重的毒副作用，因此有必要为癌症确诊患者制定新的治疗策略。

天然化合物以其高抗肿瘤活性和低毒性引起了研究人员的广泛关注。白术内酯Ⅰ(atractylenolide-I，AT-Ⅰ)是从白术中分离得到的一种天然倍半萜内酯，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理和生物学活性[4-7]。先前的研究表明，AT-Ⅰ可激活膀胱癌细胞线粒体凋亡途径，诱导细胞周期阻滞在G2/M 期并触发细胞凋亡[6]。AT-Ⅰ还通过调控ERK/GSK3β 信号通路来诱导黑色素瘤细胞的凋亡和细胞周期阻滞效应[7]。此外一项临床研究表明，AT-Ⅰ改善了胃癌恶病质患者的食欲和Karnofsky 表现状态，且观察到的不良反应较少[8]。以上这些研究表明AT-Ⅰ是一种很有前途的抗肿瘤药物，但AT-Ⅰ水溶性差、光照不稳定、渗透性低，生物利用度低，限制了其临床应用[9]。因此，为提高AT-Ⅰ的溶解度、降低口服给药的首过效应、提高生物利用率，有必要选择合适的纳米给药系统[10]。

氧化石墨烯(graphene oxide，GO)以其良好的水溶性、大的比表面积、良好的生物相容性而备受关注，其可通过π-π*堆积、静电吸引和其他分子相互作用来装载治疗药物。实验通过活化GO 表面的羧基，以聚乙二醇为中介实现精氨酸甘氨酸天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid，RGD)和GO 的共价枝接，随后通过溶剂共混完成对AT-Ⅰ的负载，成功制备负载AT-Ⅰ的RGD@GO 纳米粒子(RGD@GO-AT-Ⅰ)，并对其粒径、包封率、载药量及体外口抗肿瘤作用进行评价。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 体外观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2018 年10 月至2019 年12 月在青海大学附属医院实验室完成。

1.3 材料 AT-Ⅰ(索宝来生物科技公司)；人卵巢癌细胞A2780(美国ATCC，Manassas，VA)；N-(3-二甲氨基丙基-N’-乙基碳化二亚胺盐酸盐)(EDC)、二吡咯烷(NSUC)、六氟磷酸碳(HSPyU)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、聚乙二醇(Sigma Aldrich)；RGD 多肽序列(北京中科亚光生物科技有限公司)；GO(南京吉仓纳米科技有限公司)；Dulbecco 改良的Eagle’s 培养基(Gibco，Inc，纽约大岛)；胎牛血清(Hyclone，Co)；碘化丙啶染色液(Sigma-Aldrich Co，美国)；原子力显微镜(VEECO Dimension icon，美国)；高效液相色谱检测仪(Ultimate 3000，Dionex，Inc.US)；FAC Scaliber 流式细胞仪(Becton-Dickinson 公司，美国)；Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒(Sigma-Aldrich)。

1.4 实验方法

1.4.1 RGD@GO 的合成 将10 mL GO 溶液(约4 g/L)水浴1 h。此后，将1.2 g NaOH 和1.0 g 氯乙酸加入到GO 溶液中继续水浴3 h。加入盐酸中和，最终产物为羧酸改性GO(GO-COOH)。将改性GO 用水稀释至约1 g/L，然后用10 g/L 聚乙二醇对其进行超声水浴5 min。然后添加浓度为5 mmol/L 的EDC 超声处理30 min，然后添加过量的EDC 搅拌12 h，添加巯基乙醇终止反应。1 h 后，在PBS 中离心得到聚乙二醇化的GO 溶液，保存上清液。随后将质量浓度为 1 g/L 的 RGD 多肽水溶液100 μL 滴加到聚乙二醇化的GO 表面，室温孵育4 h，使RGD多肽以共价方式枝接在聚乙二醇化的GO 表面，得到RGD@GO。

1.4.2 载药纳米材料的制备 将5 mL 的RGD@GO(0.05 g/L)或GO(0.05 g/L)与0.5 mL 的AT-Ⅰ DMSO 溶液(2.5 mmol/L)混合，在室温下搅拌过夜。离心，将上清液通过0.45 μm 过滤器过滤，去除固体，将保留在过滤器中的GO-AT-Ⅰ或RGD@GOAT-Ⅰ清洗4-6 次，重新悬浮在去离子水中形成的GO-AT Ⅰ或RGD@GO-AT-Ⅰ，4 ℃下贮存。

1.4.3 载药纳米材料的粒径和厚度 使用原子力显微镜对GO 和RGD@GO-AT-Ⅰ的粒径和厚度进行表征。通过将5 μL质量浓度为6 mg/L 的液体悬浮液滴在云母上，置于直径为12 mm 的金属盘上；将样品密封在经Drierite?颗粒除湿的仪器室中，并通过标准优化和一系列成像设置进行成像；样品表面用30-50 μL 去离子水冲洗2 次，去除沉积盐，温和气流干燥，检测样品，使用Nanoscope 软件(7.3 版，Bruker，CA)进行评估。

1.4.4 载药纳米材料的载药量及体外释药 AT-Ⅰ的浓度通过配备C18、4.6×250 mm 色谱柱的高效液相色谱在323 nm 处测定其含量。采用高效液相色谱法测定RGD@GO-AT-Ⅰ溶液体外释放AT-Ⅰ的浓度和载药量。将5 mL 的RGD@GO(0.05 g/L)与0.5 mL 的 AT-Ⅰ DMSO 溶液(2.5 mmol/L)混合，搅拌过夜，离心，检测上清液中AT-Ⅰ的含量，根据以下公式计算载药量：载药量(%)=(总药量-上清液药物含量)/纳米载体质量×100%。

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