结肠癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，发病率也正逐年升高。早期结肠癌患者通过手术治疗预后较好，但是晚期患者的5年生存率仅有20%左右，治疗效果不佳，其死亡的主要原因是肿瘤的转移[1]。结肠癌的转移机制非常复杂，这一过程涉及癌细胞的上皮-间质转换、侵袭黏附能力、血管生成等作用[2,3]，其中上皮间充质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)是肿瘤转移的关键启动步骤，在结肠癌进展中发挥着主导作用。然而，EMT相关信号通路涉及多个分子、多条信号通路，任何针对单个分子的干预方法，都难以达到理想的逆转效果。因此，有必要寻找新的手段和策略。最近研究表明，miRNA可以通过负性调控EMT相关基因的表达，在肿瘤转移中起着重要的作用[4,5]。到目前为止，仅有少数miRNA被证实参与了肿瘤EMT的发生，miRNA在肿瘤尤其是结肠癌EMT中所起的作用及其分子机制还远未阐明。本研究通过观察miR-126的过表达对结肠癌细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭的影响及EMT相关蛋白表达的变化，观察miR-126在结肠癌转移复发中的作用并探讨可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人结肠癌细胞株SW480、SW620及HCT116为本实验室冻存；胎牛血清、RPMI medium 1640、DMEM培养基(Gibco，美国)；Trizol、LipofectamineTM2000(Life Technologies，美国)；Has-miR-126 mimics及阴性对照Cel-miR-67 mimics(上海百奥迈科，中国)；miR-126、U6引物(上海生工，中国)；RT-PCR试剂盒(Promega，美国)；SYBR Green Master(Roche，瑞士)； Matrigel基质胶、Transwell小室(Coming公司);CCK8试剂(北京碧云天公司);E-cadherin、Vimentin及GAPDH抗体(Santa Cruz公司)。其他常规试剂产自北京化工。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗的RPMI1640在37℃、5%CO2的培养箱中培养，常规换液、传代。

1.2.2 脂质体转染 按照LipofectamineTM2000说明书进行操作，用于转染的细胞，在转染前一天选取对数生长且状态良好的细胞，胰酶消化，以1×105个/孔接种细胞数接种至6孔细胞培养板中。转染当天细胞丰度可达60%～70%。每孔转染miRNA mimics 5 μl(终浓度为50 nmol/L)，转染后48 h，留取细胞、提取RNA或蛋白用于后续实验。

1.2.3 总RNA提取和qRT-PCR检测 Trizol法提取结肠癌细胞株总RNA。紫外分光光度计测量纯度和浓度。按逆转录说明书将1 μg RNA逆转录为cDNA。将得到的cDNA 5倍稀释用于荧光定量PCR反应。使用2×SYBR Green Master在ABI7500荧光定量PCR仪上测定。miRNA表达以U6作为内参。引物序列：hsa-miR-126:颈环引物5′-GTCGTA TCCAG TGCAG GGTCC GAGGT ATTCG CACTG GATAC GACCG CATT-3′，miR-126-3p forward primer:5′-GTCTC GTACC GTGAG TAAT-3′，miRNA Universal primer:5′-GTGCA GGGTC CGAGGT-3′；U6 forward primer:5′-CTCGC TTCGG CAGCA CA-3′，reverse primer:5′-AACGC TTCAC GAATT TGCGT-3′。以2-ΔΔCt法计算每组细胞miR-126的表达量。

1.2.4 CCK-8实验 细胞以5×103个/孔接种于96孔板，连续培养4 d后，每孔加入10 μl CCK8试剂与90 μl培养液，培养箱内反应2 h后，酶标仪测定在490 nm处波长的吸光度(A)，每组设6个复孔，计算平均值，重复实验3次。

1.2.5 细胞划痕实验 将细胞以5×105个/孔接种于6孔板中，培养箱中孵育培养，待细胞长满至80%时，用10 μl微量移液头消毒后在细胞板上垂直划痕，PBS洗涤细胞3次，去除脱落的细胞，加入无血清培养基。于实验第1天及培养48 h后倒置显微镜下观察各组细胞的迁移情况。

1.2.6 Transwell侵袭实验 接种前2 h用无血清培养基稀释Matrigel胶，以50 μl/孔的体积铺于小室上，放置于培养箱内2 h，细胞饥饿24 h后调整浓度为5×105 ml-1，上室接种200 μl细胞悬液，下室加入600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培养液。继续培养24 h后取出Transwell小室，弃去孔中培养液，FBS洗涤，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，用棉签擦去上室Matrigel胶和未穿过膜的细胞，PBS清洗、干燥。倒置显微镜下随机选取5个高倍视野计数穿过膜的细胞数，计算平均值，重复实验3次。

1.2.7 Western blot实验 提取细胞总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，电泳、转膜、脱脂奶粉封闭后，加入目标蛋白一抗4℃孵育过夜，与辣根过氧化酶标记二抗室温反应、孵育后，利用胶片曝光、显影、定影，图像分析仪行胶片扫描，分析灰度值。

1.3 统计学分析 应用SPSS19.0统计学软件进行统计学分析。计量资料以表示，多组计量资料比较采用样本均数比较的方差检验(LSD-t检验)；CCK8增殖实验采用重复测量方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同结肠癌细胞中miR-126的表达水平 如图1所示，相对于结肠癌细胞株SW480，miR-126在结肠癌细胞SW620和HCT116中的表达明显更低。

上一篇：树突状细胞疫苗联合抗抗体治疗小鼠肝癌的实验
下一篇：没有了