0 引言

生物样本库指收集、处理、保存人体生物材料及临床信息，并应用于生命科学研究和临床治疗的生物应用系统，生物样本库集中储存的人体生物材料包括经处理过的DNA、RNA、蛋白等生物大分子以及细胞、组织和器官[1]。大容量的生物样本信息对于理解复杂疾病的决定因素至关重要，从样本中筛选疾病的生物标志物，实现早期诊断、预测[2]，配合病人的临床信息，将基础医学研究结果和临床治疗联系在一起，使生物样本库成为精准医疗的基础[3]。在精准医疗的时代背景下，生物样本库已经应用于治疗肿瘤、免疫系统疾病、糖尿病以及新药研发等医学领域中。

近年来，生物样本资源受到越来越多关注，生物样本库取得了快速发展。1994年，中国科学院建立了中华民族永生细胞库，成为中国第一个生物样本库。自此，全国各大医院开始建设规范化的生物样本库[4]。在国际上，英国生物样本库（UKbiobank）、泛欧洲生物样本库与生物分子资源研究设施（BBMRI）和美国国立癌症研究所（NCI）样本库等影响力较大。英国生物样本库收集了50 万参与者的调查表数据、身体数据和生物样本，并进行随访开放了数据库[2,5]，是调查疾病病因的丰富资源。

生物样本质量是建设生物样本库的关键，临床研究要求生物样本提供完整的遗传信息并保持样本的功能和活性。低温环境能长期保护样本中生物大分子的信息完整性，维持细胞和组织活性，为医学科学研究提供保障[6]。建设生物样本库的目的是实际应用，因此研究针对生物样本库中细胞、组织的低温保存技术具有重要意义。本文综述了生物样本库中低温保存技术的应用现状和关键问题，总结低温保存对生物样本的损伤机制，提出低温保存技术未来的发展趋势。

1 生物样本库对低温生物技术的需求

精准医疗的本质是通过基因组和蛋白质组等组学技术和医学前沿技术，对大样本人群与特定疾病类型进行生物标记物分析鉴定、验证和应用，从而精确寻找到疾病的原因和治疗的靶点，并对一种疾病不同状态和过程进行精确分类，最终实现对于疾病和特定患者进行个性化精确治疗的目的，提高疾病诊治与预防的效益[7]。精准医疗必须通过大样本数据库，整合患者临床信息、表型与基因以及蛋白质谱等所有数据，需要有高质量的生物样本库。

生物治疗交叉融合了现代生物技术与临床医学等多学科，实现人类重大疾病精准治疗。肿瘤免疫生物治疗已被认为是除手术、放疗和化疗外的重要治疗手段，治疗方法包括肿瘤疫苗、基因治疗、过继性免疫疗法和细胞因子治疗等[8]。基因治疗过程中使用的遗传物质、细胞因子及疫苗等生物材料都需要生物样本库提供。这些生物材料不论是储存在生物样本库中，还是在进入患者体内前，都需要处在稳定的环境中，保证重要的遗传信息和细胞功能不受损伤，不会影响治疗效果。理论上低温环境能抑制生物大分子凋零和降解，有效提高生物样本质量，因此，低温保存技术已成为生物样本库应用于生物治疗的关键。

此外，低温保存技术也广泛应用于脐带血库、干细胞库和精子卵子库中，为这些重要生物资源的供受体匹配、长距离运输以及基础医学研究提供技术支持。低温保存技术也满足了个人自体储存的特别需要，甚至有望实现年轻细胞的老年使用。

2 生物样本低温保存的问题

随着生物与样本库的快速发展，如何获取高质量的生物样本并长期保存是建设生物样本库的关键。根据生物样本种类的不同，生物样本库通常的保存温度设置为室温、4、-20、-80 和-196 ℃（液氮）[9]。室温下可以短期保存固定组织切片；待处理的血液和DNA 等样本允许短时间保存于温度为4 ℃环境；长期保存DNA 样本需要在-20 ℃的低温环境；RNA、蛋白质、细胞和组织样本需要保存在-80 ℃或者液氮中[9]。但是低温同时也会损伤生物样本[10]，目前尚存在诸多问题需要解决：1）由于RNA 与蛋白质的不稳定性，长时间保存可能带来不同程度的降解；2）添加低温保护剂保存可以使细胞保持活性，但是由于冰晶损伤、渗透压损伤及保护剂等外来物质的添加，不可避免会给细胞带来一定程度的损伤；3）低温对细胞、组织形态结构及功能的影响；4）低温对DNA、RNA 和蛋白等生物大分子的影响。

样本质量是生物样本库的核心，规范化收集、处理和保存样本能够保证DNA、RNA 和蛋白等生物大分子的完整性和细胞组织的活性[11]，最重要的是能保存生物样本中的有效信息。常温下，生物样本的DNA、RNA 和蛋白会随时间发生降解，影响基因的表达量[12]。分子水平的研究要求生物样本具有高质量的核酸，如RNA 完整性计数（RIN，RNA integrity number）体现了RNA 的降解程度，一般实验中RIN 大于7 的RNA 才能进行表达谱测序。保存和使用样本中的每一个步骤都会直接影响样本质量，如组织的冷缺血时间、样本的保存条件、保存时间、保存方法和保护剂种类等。LIU 等[13]对13个不同实验室使用的HeLa 细胞系进行多组学鉴定，确定了HeLa 细胞的CCL2 亚系和Kyoto 亚系等不同细胞系间的存在变异，导致相关实验研究难以重复。高质量的生物样本是医学研究的可靠数据来源，能够保障实验结果的可靠性和可重复性[14]。

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